1. V kultivačnej platni namočte sklíčka, ktoré boli prelezené PBS, trikrát vždy na 3 minúty.
2. Fixujte sklíčka 4 percentným paraformaldehydom na 15 minút a namočte sklíčka do PBS na 3-krát, zakaždým na 3 minúty.
3. Permeabilizujte s 0,5 % Tritonom X-100 (pripraveným v PBS) počas 20 minút pri izbovej teplote (pre antigény exprimované na bunkovej membráne je tento krok vynechaný).
4. Blokovanie séra: sklíčka ponorte 3-krát na 3 minúty do PBS, vysušte PBS absorpčným papierom, pridajte na sklíčka normálne kozie sérum (za predpokladu, že sekundárnym zdrojom protilátky je koza) a blokujte pri izbovej teplote. 30 min.
5. Pridajte primárnu protilátku: Absorbujte blokovací roztok savým papierom, neumývajte, pridajte dostatočné množstvo zriedenej primárnej protilátky na každé podložné sklíčko a vložte do mokrej krabičky, inkubujte cez noc pri 4 stupňoch.
6. Pridajte fluorescenčnú sekundárnu protilátku: ponorte sklíčka do PBST na 3-krát, zakaždým na 3 minúty, absorbujte prebytočnú tekutinu na sklíčkach absorbčným papierom, pridajte zriedenú fluorescenčnú sekundárnu protilátku po kvapkách, inkubujte pri 20-37 stupni 1 hodinu v mokrej krabici namočte do PBST Slice 3-krát, zakaždým 3 minúty.
Poznámka: Od pridania fluorescenčnej sekundárnej protilátky by sa všetky nasledujúce kroky mali vykonávať čo najviac na tmavom mieste.
7. Blokovanie séra: osušte tekutinu savým papierom, na podložné sklíčko nakvapkajte normálne kozie sérum (za predpokladu, že sekundárnym zdrojom protilátky je koza) a blokujte pri izbovej teplote 30 minút.
8. Pridajte primárnu protilátku: Absorbujte blokovací roztok absorpčným papierom, neumývajte, potom pridajte zriedenú primárnu protilátku po kvapkách a inkubujte cez noc v 4-stupňovom vlhkom boxe v tme po pridaní primárnej protilátky. (Poznámka: druh druhej primárnej protilátky sa líši od druhu prvej primárnej protilátky, ako je myš a králik)
9. Pridajte fluorescenčnú sekundárnu protilátku: ponorte sklíčka do PBST na 3-krát, zakaždým na 3 minúty, absorbujte prebytočnú tekutinu na sklíčkach absorbčným papierom, pridajte zriedenú fluorescenčnú sekundárnu protilátku po kvapkách, inkubujte pri 20-37 stupni 1 hodinu vo vlhkej škatuľke namočte do PBST Slice 3x, vždy 3 min. (Poznámka: Ak je na detekciu prvej protilátky zvolená červená fluorescencia, druhá musí zvoliť iné farby fluorescencie)
10. Kontrafarbenie jadier: DAPI sa pridal po kvapkách a inkuboval sa v tme počas 5 minút, vzorky sa zafarbili a prebytok DAPI sa zmyl s PBST 5 minút x 4 krát.
11. Osušte kvapalinu na podložnom sklíčku savým papierom, utesnite podložné sklíčko pomocou upevňovacej kvapaliny obsahujúcej antifluorescenčný zhášač a pozorujte a zbierajte snímky pod fluorescenčným mikroskopom.
