Technológia PCR musí mať umelo syntetizované primerané primery a extrahovanú vzorku DNA a potom vykonať automatické tepelné cyklovanie a nakoniec vykonať identifikáciu a analýzu produktu. V súčasnosti sa môže návrh a syntéza primerov vykonávať len v niekoľkých výskumných ústavoch, ústavoch a klinikách so silnou technickou silou. Aplikácia potrebuje na začatie práce iba zakúpenie súpravy na detekciu PCR. Automatický tepelný cyklus PCR ovplyvňuje veľa faktorov. Pre rôzne vzorky DNA je množstvo rôznych zložiek pridaných do PCR reakcie a parametre teplotného cyklu nekonzistentné.
Teraz je uvedených niekoľko hlavných ovplyvňujúcich faktorov.
Po prvé, parametre teplotného cyklu
V automatickom tepelnom cykle PCR je najkritickejším faktorom teplota denaturácie a žíhania. Ako je znázornené v príklade operácie, podmienky denaturácie, žíhania a predĺženia sú: 94 °C 60 s, 37 ° 60 s, 72 °C 120 s, celkovo 25-30 A cyklus, amplifikovaný fragment má 500 bp. Tu by sa mal vypočítať čas každého kroku potom, čo reakčná zmes dosiahne požadovanú teplotu. V automatickom termocykléri trvá čas od pôvodnej teploty zmesi po požadovanú teplotu 30-60s Dĺžka tohto oneskorenia závisí od viacerých faktorov, vrátane typu reakčnej trubice, hrúbky steny, objemu reakčnej zmesi, tepla zdroj (vodný kúpeľ alebo vykurovací blok) a teplotný rozdiel medzi dvoma krokmi, ktorý by sa mal primerane zabezpečiť pri nastavovaní tepelného cyklu Venujte pozornosť a zvážte a skutočné meranie by sa malo vykonať na každom prístroji.
Ďalšou dôležitou úvahou o dobe tepelného cyklu je vzdialenosť medzi dvoma primérmi; čím väčšia je vzdialenosť, tým dlhšie trvá syntetizovanie celej dĺžky cieľovej sekvencie. Reakčný čas uvedený vyššie je založený na optimálnej dĺžke syntézy 500 bp. Vypracuje sa cieľová sekvencia. Tu je úvod k výberu rôznych teplôt.
1. Teplota denaturácie templátu Teplota denaturácie určuje teplotu, pri ktorej sa topí dvojvláknová DNA v reakcii PCR. Ak sa nedosiahne teplota denaturácie, nevytvorí sa templát jednovláknovej DNA a PCR sa nespustí. Nízka denaturačná teplota znamená neúplnú denaturáciu, DNA dvojvláknová Rýchlo sa renaturuje, čím sa zníži výťažok. Všeobecne 90-95 ℃. Keď vzorka dosiahne túto teplotu, mala by sa rýchlo ochladiť na teplotu žíhania. Denaturácia DNA trvá len niekoľko sekúnd a nie je potrebná dlho; naopak, pri vysokej teplote by ste sa mali snažiť čo najlepšie. Skráťte ju, aby sa zachovala aktivita Taq DNA polymerázy. Maximálna denaturačná teplota po pridaní Taq DNA polymerázy by nemala presiahnuť 95 °C.
2. Teplota žíhania priméru Teplota žíhania určuje špecifickosť a výťažok PCR; ak je teplota vysoká, špecificita je silná, ale ak je teplota príliš vysoká, primér nemôže byť pevne spojený s templátom a účinnosť amplifikácie DNA je znížená; teplota je nízka, výťažok je vysoký, ale príliš nízky môže spôsobiť nesúlad priméru a šablóny , Zvyšujú sa nešpecifické produkty. Vo všeobecnosti začnite s reakčnými podmienkami 37 °C, nastavte sériu kontrolných reakcií na určenie optimálnej teploty žíhania pre konkrétnu reakciu. Môže sa tiež odvodiť na základe obsahu (G+}C) % primérov na pochopenie testu Východiskovým bodom všeobecného testu, teplota žíhania Ta (teplota žíhania) je o 5 °C nižšia ako teplota topenia TTm (teplota topenia) amplifikačného primeru, ktorú možno vypočítať podľa vzorca:
Ta = Tm-5℃= 4(G{{2}}C){{4}} 2(A+T)-5℃
Medzi nimi A, T, G a C predstavujú počet zodpovedajúcich báz. Napríklad pre základný náter s 20 bázami, ak je obsah (G+C)% 50%, počiatočný bod Ta môže byť nastavený na 55°C. Pri typickej koncentrácii priméru (ako je 0,2 μmol/l) môže byť anelačná reakcia dokončená v priebehu niekoľkých sekúnd a dlhodobé žíhanie nie je potrebné.
3. Výber teploty predlžovania priméru závisí od optimálnej teploty Taq DNA polymerázy. Vo všeobecnosti 70-75 °C, štandardná rýchlosť enzýmom katalyzovaných nukleotidov pri 72 °C môže dosiahnuť 35-100 nukleotidov/s. za minútu. Dĺžku 1 kb je možné predĺžiť a jej rýchlosť závisí od zloženia tlmivého roztoku, hodnoty pH, koncentrácie soli a povahy templátu DNA. Ak je amplifikovaný fragment kratší ako 150 bp, krok predlžovania sa môže vynechať a stane sa z neho dvojteplotný cyklus, pretože Taq DNA Polymeráza je dostatočná na dokončenie syntézy krátkych sekvencií pri teplote nasadania. Pre krátke sekvenčné fragmenty medzi 100 a 300 bp je efektívne použiť rýchly a jednoduchý dvojteplotný cyklus. V tomto čase je teplota predlžovania primeru rovnaká ako teplota žíhania. Pre fragmenty DNA s veľkosťou nad 1 kb je možné regulovať čas predlžovania v rámci 1 až 7 minút podľa dĺžky fragmentu. Súčasne by sa do PCR pufra mala pridať želatína alebo činidlo BSA, aby sa Taq DNA polymeráza udržala aktívna a stabilná po dlhú dobu. Sex; 15%-20% glycerol pomáha amplifikovať približne 2,5kb alebo dlhšie fragmenty DNA.
4. Počet cyklov konvenčnej PCR je vo všeobecnosti 25 až 40 cyklov. Všeobecnou chybou je, že počet cyklov je príliš veľký, nešpecifické pozadie je vážne a zložitosť sa zvyšuje. Samozrejme, počet cyklov reakcie je príliš malý a výťažok je nízky. Preto je potrebné zabezpečiť získanie produktu. Podľa predpokladu rýchlosti by sa mal počet cyklov minimalizovať.
Po dokončení amplifikácie sa vzorka ochladí a uskladní pri 4 °C.
2. Primer Primer Design
Na amplifikáciu templátovej DNA musíte najskôr navrhnúť dva oligonukleotidové priméry. Takzvané priméry sú vlastne dva oligonukleotidové fragmenty, ktoré sú komplementárne k cieľovej sekvencii DNA, ktorá sa má amplifikovať. Vzdialenosť medzi týmito dvoma primérmi určuje dĺžku amplifikovaného fragmentu. 5'koncov dvoch primérov určuje polohy dvoch 5'koncov amplifikovaného produktu. Je možné vidieť, že priméry sú kľúčom k určeniu dĺžky, polohy a výsledkov PCR amplifikovaných fragmentov a návrh primérov je dôležitejší.
Nevyhnutnou podmienkou pre návrh priméru je, že musí byť známa cieľová sekvencia DNA komplementárna k priméru. Sekvencia medzi týmito dvoma primérmi nie je nevyhnutne jasná. Dve známe sekvencie majú vo všeobecnosti 15-20 báz, ktoré je možné syntetizovať pomocou syntetizátora DNA. V súlade s dvoma komplementárnymi primérmi okrem toho zásady, ktoré sa vo všeobecnosti dodržiavajú pri navrhovaní primérov, zahŕňajú:
1. Dĺžka priméru sa vypočíta podľa štatistík a pravdepodobnosť, že sa v ľudskom genóme môže objaviť oligonukleotidová sekvencia s približne 17 bázami, je jedna. Preto dĺžka priméru nie je vo všeobecnosti menšia ako 16 nukleotidov a najvyššia nie je väčšia ako 30 nukleotidov a najlepšia dĺžka je 20-24 nukleotidov. Takéto krátke oligonukleotidy nebudú tvoriť stabilný hybrid pri polymerizačnej teplote (prekročenie 72 °C). Niekedy to môže byť na 5' Pridajte na koniec sekvencie, ktoré nie sú komplementárne s templátom, ako sú miesta pre reštrikčné enzýmy alebo promótory, aby sa dokončilo klonovanie génu a iné špeciálne potreby; primér 5' koncová biotínová značka alebo fluorescenčná značka sa môže použiť na rôzne účely, ako je mikrobiálna detekcia.
Niekedy primer'nefunguje, dôvod je neznámy, môžete posunúť pozíciu, aby ste to vyriešili.
2. Zloženie primerov s obsahom (G+}C)% by malo byť jednotné a snažte sa vyhnúť tomu, aby obsahovali rovnaký základný polymér. Obsah (G+C)% v dvoch priméroch by mal byť čo najviac podobný, v známom amplifikovanom fragmente (G+C)% obsah by mal byť blízko fragmentu, ktorý sa má amplifikovať, vo všeobecnosti 40% až 60% je lepšie.
3. Vnútro základného náteru by sa malo vyhýbať tvorbe zjavných sekundárnych štruktúr, najmä vlásenkových štruktúr. Napríklad:
4. Medzi týmito dvoma primérmi by nemala existovať žiadna komplementácia medzi primérmi, najmä na 3' konci priméru. Aj keď sa tomu nedá vyhnúť, 3'koncová komplementárna báza by nemala byť väčšia ako 2 bázy, inak je ľahké vytvoriť"primérový dimér" Alebo"Primérový dimér" (Primer dimér). Takzvaný primérový dimér je v podstate dvojvláknový fragment DNA vytvorený predĺžením jedného priméru na druhú sekvenciu priméru pôsobením DNA polymerázy. , Je bežným vedľajším produktom PCR a niekedy sa dokonca stáva hlavným produktom.
Okrem toho sa vyhýbajte homológnym sekvenciám medzi dvoma primérmi, najmä oligonukleotidovým fragmentom s viac ako 6 po sebe idúcimi identickými bázami, inak budú dva priméry navzájom súťažiť o rovnaké miesto templátu; podobne priméry a cieľová DNA, ktorá sa má amplifikovať, alebo iné sekvencie vzorky DNA nemôžu mať homológne sekvencie s viac ako 6 bázami. V opačnom prípade sa budú priméry viazať na iné miesta, čím sa zníži špecifická amplifikácia a zvýši sa nešpecifická amplifikácia.
5. Primér 3'koncový DNA polymeráza pridáva jeden nukleotid na 3'koniec priméru. Preto požiadavky na párovanie 5-6 báz z 3' konca priméru a cieľovej DNA musia byť presné a prísne, aby sa zabezpečila efektívna PCR amplifikácia. .
Či je návrh primeru primeraný, sa dá overiť počítačovým vyhľadávaním pomocou softvéru PCRDESN a amerického softvéru PRIMER.
Umelo syntetizované oligonukleotidy by sa mali prednostne čistiť chromatografiou (chromatografiou) alebo PAGE, aby sa odstránili nečistoty, ako sú krátke reťazce, ktoré neboli syntetizované v plnej dĺžke. Vyčistené primery skladované v 25 % roztoku acetonitrilu pri 4 °C môžu zabrániť mikroorganizmom. Za normálnych okolností by sa nepoužité primery mali skladovať v chladničke pri -20 °C. Priméry sa môžu skladovať v kvapaline 6 mesiacov a po lyofilizácii sa môžu skladovať 1 až 2 roky.
