Úvod do bunkovej kultúry a jej výziev

Čo je bunková kultúra?

bunková kultúra

Bunková kultúra sa týka procesu pestovania buniek za kontrolovaných podmienok mimo ich prirodzeného prostredia. Je to nástroj in vitro, ktorý uľahčuje pochopenie bunkovej biológie a mechanizmov chorôb. Hrá tiež úlohu pri objavovaní liekov, ako je testovanie toxicity liekov a farmakokinetické/farmakodynamické štúdie, ako aj personalizovaná medicína.

Americký embryológ Ross Granville Harrison vyvinul prvé techniky kultivácie buniek in vitro na začiatku 20. storočia, keď in vitro úspešne vypestoval fragmenty tkaniva z embryí žiab. Dnes bunková kultúra pomohla nespočetným objavom, ako je vývoj vakcín proti detskej obrne, osýpkam, mumpsu a iným infekčným chorobám.

Kultúra adhézie a suspenzie

Existujú dva základné systémy pre rast buniek: adherentná kultúra a suspenzná kultúra. Adherentné kultúry sa pestujú na umelých substrátoch, zatiaľ čo bunky v suspenzných kultúrach voľne plávajú v médiu. Zatiaľ čo len niekoľko typov buniek prirodzene rastie v suspenzii (napr. lymfocyty), mnohé typy adherentných buniek možno adaptovať na suspenznú kultúru.

Existujú dva dôvody na kultiváciu prirodzene adherentných buniek v suspenzii. Prvou výhodou suspenznej kultúry je, že bunky sa ľahšie pasážujú, pretože ich nemusíte enzymaticky alebo mechanicky oddeľovať od kultivačnej nádoby. Po druhé, suspenzné kultúry sa ľahšie zväčšujú, pretože rast buniek je obmedzený len ich koncentráciou v médiu, nie dostupnou povrchovou plochou. Hlavnou nevýhodou suspenzných kultúr je to, že vyžadujú denné počty buniek a testy životaschopnosti na sledovanie vzorcov rastu, zatiaľ čo adherentné kultúry možno ľahko skúmať pod mikroskopom.

2D a 3D metódy

Adherentné kultúry môžeme ďalej rozdeliť na 2D a 3D kultúry. V 2D aplikáciách sa adherentné bunky pestujú v monovrstvovom systéme na rovnom povrchu, ako je napríklad banka na kultiváciu buniek.

bunková kultúra

Vďaka svojej jednoduchosti nemôže 2D technológia napodobňovať in vivo prostredie buniek, ktoré zvyčajne rastú v trojrozmerných štruktúrach so zložitými interakciami medzi bunkami. To je dôvod, prečo sa niektoré experimenty vykonávajú pomocou 3D kultúr, ktoré možno pestovať pomocou technológií založených na lešení alebo bez lešenia.

3D metódy založené na lešení typicky zahŕňajú rast adherentných buniek v hydrogélových lešeniach. Pre niektoré aplikácie sa používajú aj alternatívy ako biokeramické, kovové alebo polymérové ​​lešenia.

Techniky bez lešenia sa používajú na pestovanie sféroidov jednou z troch rôznych metód:

Forced Float: Bunkovú suspenziu vložte do jamiek mikrodoštičky s nízkou priľnavosťou potiahnutej polymérom. Mikroplatnička sa potom odstredí, aby sa bunky prinútili vytvoriť sféroidy.

Závesná kvapka: Bunková suspenzia sa vloží do jamiek závesnej doštičky. Ako už názov napovedá, suspenzia bude visieť na tanieri ako kvapôčky. Bunky sa zhlukujú na špičkách týchto kvapiek a vytvoria gule.

Na základe miešania: Bunková suspenzia sa umiestni do rotujúceho bioreaktora. V dôsledku neustáleho miešania bunky neboli schopné priľnúť k stenám, čím sa vytvorili sféroidy.

Výzva bunkovej kultúry

Napriek rozdielom v metódach a technikách majú všetky experimenty jedno spoločné: je ťažké pestovať živé bunky v požadovanom počte, aby sa dosiahli reprodukovateľné výsledky. Preto budú nasledujúce časti venované štyrom výzvam – opakovateľnosti, kontaminácii, realizovateľnosti a prechodu na automatizáciu.

reprodukovateľnosť

Podľa prieskumu Yongyue Medical viac ako 70 percent vedcov uviedlo, že nedokázali reprodukovať experimenty iného vedca a viac ako polovica nedokázala reprodukovať svoje vlastné dielo. V testoch na bunkových kultúrach väčšina problémov s reprodukovateľnosťou vzniká z biologických rozdielov medzi pasážami alebo generáciami buniek. Ďalším veľkým problémom je chybná identifikácia bunkových línií a významnú úlohu zohrávajú aj nezrovnalosti v parametroch kultivácie.

biologická variácia

Faktory, ako sú náhodné mutácie alebo chyby transkripcie, majú potenciál ovplyvniť reprodukovateľnosť experimentov pri každom delení bunky. Aby ste tomu zabránili, mali by ste na začiatku nového projektu vytvoriť bunkovú banku.

bunkovej banky

Bunkové bankovanie sa týka procesu ukladania dávok špecifických typov buniek na neskoršie použitie, aby sa predišlo faktorom, ako sú náhodné mutácie alebo chyby transkripcie, ktoré ovplyvňujú reprodukovateľnosť. Prvým krokom je vytvorenie hlavnej bunkovej banky (MBC) pestovaním vybraných typov buniek, o ktoré je záujem v kultúre, a ich kryokonzerváciou vo viacerých nádobách. Šarže MBC sa rozmrazia a použijú sa neskôr na prípravu pracovných bunkových bánk (WBC).

Nesprávna identifikácia bunkových línií

Problém nesprávnej identifikácie bunkových línií je známy už od 60. rokov 20. storočia, keď vedec opísal kontamináciu buniek HeLa 19 ďalších ľudských bunkových línií. Aby ste sa uistili, že vaše výsledky sú spoľahlivé a čo je dôležitejšie, aby ste nevyvodili falošné závery, mali by ste všetky nové bunkové línie vstupujúce do laboratória umiestniť do karantény, kým sa neoverí ich pôvod. Najdôležitejšie je, že sa odporúča zopakovať kvalifikáciu bunkovej línie pred kryokonzerváciou a distribúciou do iných laboratórií a po dokončení projektu. Ak chcete overiť bunkovú líniu, mali by ste najprv skontrolovať, či je uvedená v registri nesprávne identifikovaných bunkových línií. Ak nie je zaregistrovaný, musíte ešte potvrdiť jeho pravosť. Pre ľudské bunkové línie sa odporúča analýza krátkeho tandemového opakovania (STR) (DNA fingerprinting). Pre nehumánne bunkové línie sú dostupné rôzne testovacie metódy, vrátane karyotypizácie, izoenzýmovej analýzy a typizácie mitochondriálnej DNA (čiarové kódovanie DNA).

Parametre kultúry

Tretím faktorom ovplyvňujúcim reprodukovateľnosť sú parametre kultúry.

Napríklad hladina kyslíka môže výrazne ovplyvniť kultivované bunky. Premenné, ktoré ovplyvňujú okysličovanie, ako je veľkosť komory alebo hustota buniek, však nie sú vždy zdokumentované, a preto ich nemožno udržiavať konzistentné.

Ďalším dôležitým parametrom kultúry je médium. To poskytuje základné živiny, rastové faktory a hormóny a reguluje pH a osmotický tlak. Preto je najdôležitejšie, aby jeho zloženie bolo vždy rovnaké. Toto je obzvlášť dôležité pre stredné formulácie doplnené fetálnym bovinným sérom (FBS), ktorého zloženie závisí od faktorov, ako je strava kráv, geografická poloha a ročné obdobie. Aby ste minimalizovali vplyv FBS na reprodukovateľnosť výsledkov, mali by ste si objednať rôzne šarže séra, keď sa súčasné zásoby začnú míňať a otestovať ich, aby ste našli najbližšiu zhodu. Aby ostatní mohli reprodukovať vaše výsledky, mali by ste nahlásiť, ako ste vykonali skríning séra a zaznamenať číslo šarže.

bunková kultúra

Spracovanie buniek

Väčšina výskumníkov vie, že parametre kultúry majú obrovský vplyv na ich aplikácie, ale zmeny v technikách spracovania sú často prehliadané.

Znečistenie

Keď sú bunky izolované z tkaniva a pestované v laboratóriu, už nie sú chránené imunitným systémom, a preto sú extrémne citlivé na kontamináciu.

Prvým zdrojom kontaminácie sú abiotické kontaminanty, ako sú nečistoty v kultivačnom médiu, sére, suplementoch alebo vode, ako aj endotoxíny a vylúhovateľné látky. Preventívne opatrenia zahŕňajú použitie laboratórnej vody na experimenty s bunkovou kultúrou a médií, séra, doplnkov a spotrebného materiálu od výrobcov, ktorí ponúkajú certifikáciu na testovanie endotoxínov. Okrem toho musí byť spotrebný materiál vyrobený z pôvodného polystyrénu alebo polypropylénu, aby sa zabezpečilo, že plastové prísady nepreniknú do vašej bunkovej kultúry.

Druhým zdrojom kontaminácie sú biologické kontaminanty ako baktérie (vrátane mykoplazmy), plesne a kvasinky.

realizovateľnosť

Životaschopnosť buniek je definovaná ako podiel životaschopných buniek vo vzorke. Okrem kontaminantov, ktoré sme práve videli, existujú rôzne ďalšie faktory, ktoré ovplyvňujú životaschopnosť buniek. Podmienky prostredia – teplota, pH, osmotický tlak, dostupnosť živín a koncentrácie O2 a CO2 – sú veľmi dôležité. Väčšina týchto premenných je riadená médiom a sú špecifické pre typ bunky, čo bohužiaľ znamená, že nemôžeme poskytnúť konkrétne pokyny.

Keďže články sú veľmi citlivé na tlak, mali by ste venovať pozornosť nielen podmienkam prostredia, ale aj technikám manipulácie s kvapalinami.

Posledným faktorom ovplyvňujúcim životaschopnosť buniek je starnutie. Väčšina konečných bunkových línií prežije 20 až 60 delení pred smrťou, čo znamená, že môžu byť znovu použité iba medzi 15 a 45 generáciami. Potom je potrebné kryokonzervovanú vzorku z bunkovej banky rozmraziť. Kontinuálne bunkové línie sa môžu množiť donekonečna, ale pretože sú náchylné na genetický drift, mali by sa pravidelne vymieňať.

Na meranie životaschopnosti buniek možno použiť detekčné testy využívajúce kolorimetrické, fluorometrické a bioluminiscenčné metódy. Bežne používanou kolorimetrickou metódou je metóda MTT, ktorá je založená na redukcii žltých tetrazóliových solí na fialové kryštály formazanu živými bunkami.

96-jamkové platne

automatizácie

Mnohé z problémov opísaných vyššie možno vyriešiť automatizáciou pracovných postupov bunkovej kultúry. Napríklad manipulácia s bunkami bude vždy konzistentná, čo bude mať pozitívny vplyv na reprodukovateľnosť a životaschopnosť. Najdôležitejšie je, že automatizácia znižuje riziko kontaminácie používateľa.

Napriek týmto výhodám môže byť automatizácia celých pracovných postupov náročná z dôvodu rozpočtu, nedostatku miesta pre roboty alebo preto, že nie je dostatok zdrojov na automatizáciu a overenie každého kroku naraz. Ale toto sa dá vyriešiť!