V postepidemickej ére je pojem „testovanie nukleových kyselín“ známy každému z nás a stal sa súčasťou nášho každodenného života.
Takže, viete, ako testovanie nukleových kyselín zisťuje vírusy? A ako testovanie nukleových kyselín robí neviditeľné vírusy „viditeľnými“?
01 Čo je nukleová kyselina
Nukleová kyselina je všeobecný termín pre DNA a RNA.
Nukleová kyselina je základnou zložkou všetkého známeho života na Zemi. DNA, o ktorej často hovoríme, je kyselina deoxyribonukleová. Genetický materiál nového koronavírusu je RNA – ribonukleová kyselina.
Testovanie amplifikácie nukleových kyselín
02 Čo presne zisťuje testovanie nukleových kyselín?
Látkou na detekciu nukleovej kyseliny je nukleová kyselina vírusu.
Nový koronavírus je vírus, ktorý obsahuje iba RNA a špecifická sekvencia RNA vo víruse je marker, ktorý odlišuje vírus od iných patogénov. Detekcia nukleovej kyseliny má zistiť, či sa vo vzorke alebo krvi pacienta nachádza nukleová kyselina cudzieho invázneho vírusu, aby sa zistilo, či je infikovaný novým koronavírusom. Prevažná väčšina súčasnej detekcie nukleových kyselín nového koronavírusu využíva fluorescenčnú kvantitatívnu PCR metódu na amplifikáciu cieľovej sekvencie vírusovej RNA pomocou PCR po reverznej transkripcii.
PCR alebo polymerázová reťazová reakcia je technika molekulárnej biológie používaná na amplifikáciu špecifických fragmentov DNA; ide o DNA polymerázou katalyzovanú reakciu špecifických génov alebo Reakcia rýchlej in vitro amplifikácie DNA sekvencií sa tiež nazýva génová in vitro amplifikácia. Fluorescenčná kvantitatívna PCR technológia je pridať fluorescenčný reportérový systém do PCR reakčného systému a použiť zmenu fluorescenčného signálu na monitorovanie procesu PCR v reálnom čase, aby sa realizovala kvantitatívna detekcia počiatočného templátu.
Na detekciu nukleovej kyseliny je prvým krokom odber vzorky. V súčasnosti je najbežnejšou metódou odberu: výtery z hrdla alebo výtery z nosa na výter a odber horných dýchacích ciest (hltanu alebo nosovej dutiny); zozbierané vzorky budú prísne zapečatené a následne odoslané do laboratória na postupné testovanie.
1. Extrakcia vírusovej RNA
Zo vzorky sa najskôr extrahuje RNA vírusu. Pridajte do vzorky činidlá na extrakciu nukleovej kyseliny, aby ste zničili vírus a uvoľnili nukleovú kyselinu.
2. "Reverzná transkripcia" vírusovej RNA do cDNA
Prostredníctvom technológie reverznej transkripcie (RT) sa RNA vírusu „obráti“ na špecifickú DNA, ktorá je vhodnejšia na detekciu, teda cDNA.
3. Amplifikácia a detekcia cDNA
V skutočnosti, či už ide o výter z hrdla, výter z nosa alebo dokonca odber krvi, obsah vírusu vo vzorke je relatívne nízky, dokonca aj u ťažko infikovaných pacientov (vírusová záťaž je veľká); pretože vírusové častice sú príliš malé a objem vzorky je obmedzený. Počet vírusov obsiahnutých vo vzorke je stále príliš malý na detekciu nukleových kyselín.
Inšpektori preto pomocou technológie PCR zosilnia jedinečné „heslo“ nového koronavírusu vo vzorke do bodu, keď ho zariadenie dokáže odhaliť, aby mohli posúdiť, či ide o pozitívnu infekciu. Celý proces získavania genetického materiálu vírusu je ako rybolov. Háčik ho identifikuje a uchopí, takže vírus sa nemá kam schovať.
Jednoducho povedané, ide o amplifikáciu počtu cDNA, aby sa cDNA kontinuálne replikovala, takže počet sa zvyšuje exponenciálne.
Štandardný proces PCR je rozdelený do troch krokov:
Denaturácia: Použitie vysokej teploty na oddelenie dvojitých reťazcov DNA. Vodíkové väzby medzi dvojvláknami DNA sa prerušia pri vysokej teplote (93 - 98 stupeň).
Žíhanie: Po oddelení dvojitých reťazcov DNA sa teplota zníži, aby sa priméry mohli naviazať na jednovláknovú DNA.
Predĺženie: DNA polymeráza syntetizuje komplementárne vlákno pozdĺž vlákna DNA z priméru naviazaného pri znížení teploty. Po dokončení predlžovania sa dokončí jeden cyklus a počet fragmentov DNA sa zdvojnásobí. Opakujte tieto tri kroky 25-35-krát a počet fragmentov DNA sa exponenciálne zvýši.
PCR dvojvláknový templát
Zatiaľ čo sa cDNA amplifikuje, fluorescenčné sondy v súprave pracujú súčasne. Uvoľní fluorescenčný signál a zakaždým, keď sa cDNA zosilní, fluorescenčný signál sa trochu zvýši a detektor PCR môže zaznamenať hodnotu Ct zvýšenia fluorescenčného signálu.
Hodnota Ct je dôležitým ukazovateľom na posúdenie, či je nukleová kyselina vírusu negatívna alebo pozitívna. Čím menej počiatočnej DNA, tým viac cyklov PCR je potrebných na dosiahnutie určitého prahu a tým vyššia je hodnota Ct. Naopak, čím viac počiatočnej DNA, tým nižšia je hodnota Ct. Počiatočné množstvo DNA odráža množstvo vírusovej RNA vo vzorke, čo zase odráža množstvo vírusu vo vzorke. Preto, ak hodnota Ct nie je zistená alebo je vyššia ako určitá hodnota, potom je podozrivý pacient hodnotený ako negatívny; ak je nižšia ako táto hodnota, potom sa podozrivý pacient hodnotí ako pozitívny.
Počas PCR reakcie je výber spotrebného materiálu PCR tiež jedným z najdôležitejších faktorov ovplyvňujúcich výsledky detekcie nukleových kyselín.