Dnes si povieme niečo o kľúčovom prvku v PCR experimentoch – o spotrebnom materiáli. Ako častý návštevník PCR je potrebné porozumieť charakteristikám a terminológii súvisiacej so spotrebným materiálom PCR.
Na trhu existuje široká škála spotrebného materiálu pre PCR, vrátane značiek, špecifikácií, farieb atď., ktoré sú oslnivé. Poďme to pochopiť krok za krokom.
pcr tanier
1. Materiály
Surovinou spotrebného materiálu PCR je zvyčajne polypropylén. Je to dobrý tepelne odolný inertný materiál. Rozsah pracovných teplôt je -30 až 140 stupňov , čo mu umožňuje odolávať zmenám tepelnej energie počas tepelného cyklu reakcie PCR a zohráva dobrú úlohu pri utesňovaní a ochrane látok v reakčnom systéme PCR.
Zistite viac o polypropyléne
2. Farba
Bežné sú biele skúmavky a priehľadné skúmavky PCR. V tradičných PCR experimentoch nie je medzi nimi žiadny rozdiel. V rovnakom experimente v reálnom čase/qPCR však boli biele trubice relatívne citlivejšie a konzistentnejšie pre nástroje qPCR s apikálnymi hodnotami signálu (pozri obrázky A a B nižšie). prečo je to takto?
pcr trubica
A: nižšie hodnoty Ct pre biele trubice v porovnaní s čírymi trubicami; B: lepšia opakovateľnosť s bielymi trubicami.
Základnými údajmi qPCR je hodnota Ct a fluorescenčný signál je zdrojom údajov na výpočet hodnoty Ct, takže je veľmi dôležité, či sa fluorescencia v skúmavke môže úplne preniesť do detektora. Biela stena trubice bráni prechodu fluorescencie cez stenu trubice a jej lámaniu (obrázok A nižšie), čím zabraňuje prenosu fluorescencie do vykurovacieho bloku (tj steny kovového otvoru, kde je trubica umiestnená) a jej absorpcii. alebo nedôsledne odráža blok. Silnejší a koncentrovanejší fluorescenčný signál sa zbieral na špičke bielej skúmavky v porovnaní s čírou skúmavkou (obrázok B nižšie).
pcr trubica
Odpoveď: Meniaci sa trend fluorescenčného signálu v priehľadnej trubici a bielej trubici; B: Porovnanie intenzity fluorescencie po pridaní rovnakého množstva fluoresceínu.
Ak teda používate prístroj qPCR s najvyšším čítaním, skúste biele trubice.
3. Kvalita (štíhla alebo neštíhla)
Zdôrazňuje sa tu dôležitosť kvality spotrebného materiálu. Spotrebný materiál qPCR nesmie obsahovať kontaminanty a inhibítory. Vysoký tlak a žiarenie odstraňujú baktérie a DNázy, ale nie zvyšky prachu a DNA, ktoré môžu inhibovať PCR reakcie alebo produkovať nešpecifickú amplifikáciu. Látky majú absorbanciu a dokonca aj malé znečisťujúce látky absorbujú fluorescenciu v reakčnom systéme a ovplyvnia zber fluorescenčných signálov. Na demonštráciu vplyvu kontaminácie nečistotami na experiment bola použitá prehnaná verzia experimentu. Ako je znázornené na obrázku nižšie, do jednej z reakčných jamiek oktávy sa umiestnila nečistota. Ako sa očakávalo, amplifikačné krivky vykazovali výrazné anomálie.
Nečistoty v skúmavkách PCR
↑ Nečistoty v reakčnej skúmavke
8 pásikov
↑ Výsledky opakovanej reakcie pre 8 skúmaviek, nečistota v ľavej jamke „odchýli“ krivku.
Pripomienka: Dávajte pozor, aby ste spotrebný materiál dlho nevystavovali vzduchu. Po vybratí spotrebného materiálu nezabudnite obal rýchlo uzavrieť, aby ste sa ho nedotkli holými rukami. Ak je to možné, pracujte na čistej lavici.
4. Kapacita / Veľkosť / tok
Objem určuje, koľko vzorky (reakčného objemu) je možné naplniť. Predávkovanie môže mať za následok zníženú účinnosť prenosu tepla, rozliatie alebo krížovú kontamináciu; poddávkovanie môže viesť k strate vzorky odparovaním. Vyhrievací blok prístroja qPCR tiež určí použiteľný spotrebný materiál a použiteľnú veľkosť reakčného systému. Priepustnosť je ľahko pochopiteľná, je to maximálny počet vzoriek, ktoré je možné načítať v jednom experimente. Špecifikácie bežnej kapacity a toku sú uvedené v tabuľke nižšie:
Jedna skúmavka/osem radov {{0}},2 ml, 0,1 ml
{{0}}doštička s jamkami 0,2 ml, 0,1 ml
{{0}}doštička s jamkami 0,2 ml
Špecifikácie kapacity sú tiež vo všeobecnosti rozdelené na štandardné a nízke typy, ako je uvedené nižšie. Nízkoprofilový spotrebný materiál má nižšiu výšku. Táto krátka konštrukcia minimalizuje priestor nad reakčným systémom ("mŕtvy objem" - zbytočná časť), znižuje účinky vyparovania počas tepelných cyklov a umožňuje, aby sa vykurovací modul vo väčšej miere obklopil, aby sa zlepšila účinnosť prenosu tepla. Preto sú nízkoprofilové rúry známe aj ako „rýchle“ rúry alebo dosky.
pcr trubica
Pripomienka: Bežne používaný reakčný objem je 20 µl a odporúča sa použiť reakčnú skúmavku s malým objemom 0,1 ml alebo malý objem.
5. Hrúbka steny
Hrúbka steny rúrky priamo ovplyvňuje tepelnú vodivosť. Spotrebný materiál PCR by mal mať jednotnú hrúbku steny, aby sa zabezpečil konzistentný prenos tepla. Ultratenká stena trubice je o 50 percent tenšia ako štandardná verzia, čo ešte viac znižuje tepelnú bariéru a prináša rýchlejšiu a lepšiu odozvu. Preto, aby sa maximalizovala účinnosť PCR reakcií a zabezpečili sa stabilné a účinné reakcie, najlepšou voľbou sú jednotné a ultratenké spotrebné materiály pre PCR.
6. Transparentnosť
Uzávery a tesniace fólie pre qPCR vyžadujú vysokú optickú čistotu, aby sa zabezpečila optimálna penetrácia a prenos fluorescenčných signálov a zároveň sa znížilo skreslenie (pre prístroje qPCR s najvyšším čítaním). Čím vyššia je priehľadnosť steny skúmavky, môže to ovplyvniť výsledky experimentu. Dôvod bol vysvetlený vyššie. Tradičná PCR môže túto funkciu ignorovať.
7. Sukne
Okraj doštičky PCR sa týka periférneho predĺženia platne. Pri budovaní reakčných systémov funguje plášť ako stabilná podpora pre pipetovacie procesy a poskytuje mechanickú pevnosť a priľnavosť v kombinácii s automatizovanými pracovnými stanicami. Existujú tri bežné typy sukní, polovičné sukne a celé sukne (zodpovedajúce A, B a C na obrázku nižšie).
Skirtless: Môže byť použitý s väčšinou PCR alebo qPCR prístrojov, ale nie pre automatizované aplikácie. Ľahko sa pohybuje počas pipetovania, nie je príliš stabilný, je potrebné použiť držiak doštičiek.
Polovičné obruby: Ideálne pre automatizované aplikácie s dobrou stabilitou pipetovania.
Plná sukňová doska: Ideálna pre automatizované aplikácie. Dobrá mechanická pevnosť, vhodné pre PCR prístroje s vyčnievajúcimi modulmi, vysoká stabilita pri pipetovaní.
pcr tanier
Tipy: Význam sukne je skôr na uľahčenie industrializácie a automatizovaného dávkového spracovania v kombinácii s robotickým ramenom. V tradičných výskumných laboratóriách to nemusí byť potrebné, žiadna sukňa nestačí.
pcr tanier
8. Parafilm
Tesniaca fólia PCR platne je vyrobená z priehľadnej plastovej alebo hliníkovej fólie. Lepiace priehľadné fólie sú bežnejšie, vhodné pre 96 alebo 384 jamkové platne a mali by mať dostatočne dobrú priepustnosť svetla. Pri utesňovaní fólie sa použije malá karta na pritlačenie fólie okolo tesniaceho otvoru, aby sa zabránilo úniku vzduchu.
Menej časté môžu byť lepiace hliníkové fólie. Hoci nie je vhodný pre qPCR, je ideálnym spotrebným materiálom pre vzorky citlivé na svetlo. Pretože môže byť dierovaný, uľahčuje prenos vzorky v PCR (pre konvenčnú PCR).
PCR doštičkový tesniaci film
Zhrnúť
Ako nosič systému PCR je spotrebný materiál veľmi dôležitý na zlepšenie kvality experimentálnych údajov. Dúfam, že vám toto zdieľanie pomôže porozumieť niektorým tipom o spotrebnom materiáli PCR a poskytne pomoc pri lepšom výbere spotrebného materiálu.
