Keď ste práve promovali a vstúpili do práce, čelíte množstvu podstatných mien, ktoré čelia kvantitatívnym PCR experimentom v reálnom čase. Ste zmätení, kde začať? Aký je význam amplifikačnej krivky, štandardnej krivky, prahovej hodnoty, hodnoty CT, krivky topenia a základnej línie? Fluorescenčné obrázky z týchto experimentov sú príliš jasné, ale nedokážem ich identifikovať. Dnes vás zoznámime s týmito znalosťami a konceptmi v dvoch častiach: odborné výrazy a často kladené otázky.
Časť I Odborné podmienky
1. Krivka amplifikácie
Amplifikačná krivka sa týka krivky, kde číslo cyklu je os a intenzita fluorescencie v reálnom čase počas reakcie je ordináta počas PCR.
2. Základná línia
Základná línia označuje malú zmenu fluorescenčného signálu počas prvých niekoľkých cyklov amplifikačnej reakcie PCR. Úroveň signálu sa zobrazuje blízko priamky, ktorá je základnou čiarou.
3. Nastavenie prahu fluorescencie
Typicky sa ako signál fluorescenčného pozadia používa fluorescenčný signál prvých 15 cyklov reakcie PCR a prah fluorescencie je 10-násobok štandardnej odchýlky fluorescenčného signálu počas 3-15 cyklov PCR a prah fluorescencie je nastavený počas exponenciálnej fázy PCR amplifikácie. Typicky má každý prístroj pred použitím svoj prah fluorescencie.
4. Hodnota CT
Hodnota CT predstavuje počet cyklov, ktoré sa vyskytnú pre každú reakčnú skúmavku PCR, keď fluorescenčný signál dosiahne nastavený prah. Z výskumu vieme, že existuje lineárny vzťah medzi hodnotou CT každej šablóny a logaritmom počiatočného počtu kópií tejto šablóny. Čím vyšší je počiatočný počet kópií, tým menšia je hodnota CT a naopak. Pomocou štandardov so známymi počiatočnými číslami kópií je možné vytvoriť kalibračnú krivku, kde x x predstavuje logaritmus počiatočného počtu kópií, zatiaľ čo ordináta predstavuje hodnotu CT. Preto, pokiaľ sa získa hodnota CT neznámej vzorky, počiatočný počet kópií vzorky sa môže vypočítať zo štandardnej krivky.
vedieť viac
Existuje niekoľko indikátorov na posúdenie, či je krivka amplifikácie dobrá alebo nie:
Odpoveď: Inflexný bod krivky je zrejmý, najmä exponenciálna fáza vzorky nízkej ťažkej frakcie je zrejmá, celková rovnobežnosť amplifikačnej krivky je veľmi dobrá, základná čiara je plochá, nedochádza k žiadnemu stúpajúcemu javu a zosilnenie krivka vzorky nízkoúrovňovej exponenciálnej fázovej koncentrácie je veľmi dobrá. zrejmé.
B: Sklon exponenciálnej fázy krivky je priamo úmerný účinnosti zosilnenia, čím väčší je sklon, tým vyššia je účinnosť zosilnenia.
C: Štandardná základná línia je plochá alebo mierne klesajúca, bez zjavného stúpajúceho trendu.
D: Paralelnosť amplifikačných kriviek pre každú skúmavku je dobrá, čo naznačuje, že účinnosť amplifikácie každej reakčnej skúmavky je podobná.
5. Krivka topenia
Keď sa produkt PCR zahrieva, ako teplota stúpa, produkt dvojvláknovej amplifikácie postupne disociuje, čo vedie k zníženiu intenzity fluorescencie. Po dosiahnutí určitej teploty sa oddelí veľké množstvo produktu, čo má za následok prudký pokles fluorescencie. Použitie tejto funkcie spolu s rôznymi hodnotami TM pre rôzne produkty PCR sa tiež líši v teplote, pri ktorej fluorescenčný signál rýchlo klesá, čo môže byť dobrý spôsob na identifikáciu špecifickosti PCR.
6. Krivka topenia (pomocou logaritmickej krivky)
Vrcholový graf je tvorený logaritmom krivky topenia pre intuitívnejšie zobrazenie situácie fragmentov produktu. Keďže teplota topenia je hodnota TM fragmentu DNA, možno určiť určité parametre ovplyvňujúce hodnotu TM fragmentu DNA, ako je veľkosť fragmentu, obsah GC atď. Vo všeobecnosti sa podľa nášho princípu návrhu priméru zvyčajne hovorí že dĺžka amplifikovaného produktu je v rozsahu 80-300bp a teplota topenia by mala byť medzi 80 stupňami a 90 stupňami .
Odpoveď: Ak existuje iba jeden hlavný vrchol medzi 80 stupňami a 90 stupňami, znamená to, že PCR v reálnom čase je dokonalá.
B: Ak sa hlavný pík objaví medzi 80 stupňami a 90 stupňami a vrchol nečistôt sa objaví pod 80 stupňami, v zásade sa uvažuje primér-dimér. Toto je dobrá možnosť, ktorú môžete skúsiť vyriešiť zvýšením teploty žíhania.
C: Ak sa hlavný vrchol objaví medzi 80 stupňami a 90 stupňami a pri zvýšení teploty sa objaví pohyblivý vrchol, v zásade sa uvažuje o kontaminácii DNA. A DNA je potrebné odstrániť v počiatočných fázach experimentu.
7. Štandardná krivka
Štandardné štandardy boli nariedené na rôzne koncentrácie a použité ako templáty pre PCR reakcie. Štandardná krivka je vynesená s logaritmom štandardného počtu kópií ako úsečka a nameraná hodnota CT ako ordináta. Pri kvantifikácii neznámej vzorky možno počet kópií vzorky získať zo štandardnej krivky na základe hodnoty CT neznámej vzorky. Štandardné krivky sú veľmi dôležité pre absolútnu kvantifikáciu.
druhá časť. bežný problém
Q1: Aký je rozdiel medzi RT-PCR, QPCR, PCR v reálnom čase a RT-PCR v reálnom čase?
A1: RT-PCR je reverzná transkripčná PCR, ktorá je široko používaným variantom polymerázovej reťazovej reakcie. V RT-PCR sa vlákno RNA reverzne transkribuje do komplementárnej DNA, ktorá sa potom použije ako templát pre PCR na amplifikáciu DNA pomocou PCR.
PCR v reálnom čase a QPCR sú to isté, obe sú kvantitatívne PCR v reálnom čase, čo znamená, že v každom cykle počas procesu PCR dochádza k zaznamenávaniu údajov v reálnom čase. Týmto spôsobom je možné presne analyzovať počet štartovacích šablón.
Hoci sa zdá, že PCR v reálnom čase aj PCR s reverznou transkripciou sú skrátené ako RT-PCR, medzinárodná konvencia je taká, že RT-PCR špecificky označuje PCR s reverznou transkripciou, zatiaľ čo PCR v reálnom čase sa často označuje skratkou qPCR (Quantitative Real- True Real-True Real PCR ) - time PCR).
RT-PCR v reálnom čase (RT-QPCR) je typ reverznej transkripčnej PCR, ktorá kombinuje fluorescenčné kvantitatívne techniky: prvá reverzná transkripcia z RNA na získanie cDNA (RT), po ktorej nasleduje kvantitatívna analýza pomocou PCR v reálnom čase (QPCR).
Otázka 2: Prečo je dĺžka amplifikovaného produktového fragmentu fluorescenčnej kvantitatívnej PCR kontrolovaná v rozsahu 80-300bp?
A2: Dĺžka každej génovej sekvencie je iná, niektoré z nich majú niekoľko Kb a stovky BP. Keď však navrhujeme primér, potrebujeme len vyžadovať, aby dĺžka produktu bola 80-300bp, a príliš krátky alebo príliš dlhý nie je vhodný na kvantitatívnu detekciu PCR.
Fragmenty produktu sú príliš krátke na to, aby sa dali odlíšiť od primer-dimérov. Dĺžka primer-diméru je približne 30-40bp, keď je menšia ako 80 bp, je ťažké rozlíšiť, či ide o primer-dimér alebo produkt. Ak je fragment produktu príliš dlhý, presahuje 300 bp, ľahko to povedie k nízkej účinnosti amplifikácie a množstvo génu sa nedá efektívne detegovať.
Napríklad, keď spočítate počet ľudí v triede, stačí spočítať, koľko je tam úst. To isté platí aj pri testovaní génov. Potrebujete iba zistiť určitú sekvenciu génu, aby ste reprezentovali celú sekvenciu. Je ľahké urobiť chybu, ak pri počítaní ľudí počítate ústa aj nosy, uši a okuliare.
Q3: Aká je optimálna dĺžka pre návrh základného náteru?
Odpoveď 3: Všeobecne povedané, dĺžky primérov v rozsahu 20-24bp sú dobré. Samozrejme, pri návrhu primeru musíme dbať na hodnotu TM primeru, pretože súvisí s optimálnou teplotou žíhania. Po mnohých experimentoch sa ukázalo, že 60 stupňov je dobrá hodnota TM. Nízka teplota žíhania môže ľahko viesť k nešpecifickej amplifikácii, zatiaľ čo vysoká teplota žíhania zvyčajne vedie k nízkej účinnosti amplifikácie, neskorému vrcholu amplifikačnej krivky a oneskorenej hodnote CT.
Otázka 4: Ovplyvňuje množstvo odobratej vzorky výsledky experimentu?
A4: Nie. Je zrejmé, že čím viac vzoriek sa odoberie, tým viac RNA sa extrahuje, tým viac cDNA a tým viac cieľových fragmentov bude. Pre absolútnu kvantifikáciu je potrebné vypočítať počet kópií cieľového fragmentu a množstvo odobratej vzorky určite ovplyvní výsledky experimentu. Napríklad detekcia vírusu hepatitídy C HBV v krvi spočíva v detekcii obsahu HBV v určitom množstve (1 ml) krvi.
Pre relatívnu kvantifikáciu bežne používanú vo vedeckom výskume nemá počet vzoriek nič spoločné s experimentálnymi výsledkami, pretože relatívna kvantifikácia sa týka porovnania medzi cieľovým génom a referenčným génom. Len ich prosím považujte za upstream a downstream fragmenty prítomné v rovnakom vlákne nukleovej kyseliny. Ak je veľkosť vzorky veľká, referenčné aj cieľové gény sa súčasne zvýšia v rovnakých pomeroch, čo neovplyvní výsledky.
Otázka 5: Ovplyvní účinnosť reverznej transkriptázy experimentálne výsledky?
A5: To isté ako vyššie. Všimnite si, že chceme vyššiu účinnosť RT, ale uprednostňujeme, aby bol enzým RT relatívne stabilný a získal jednotné výsledky. Pôjde o test optimalizovaných schopností reverzných transkripčných balíkov veľkých spoločností.
Otázka 6: Ovplyvňuje účinnosť enzýmu TAQ experimentálne výsledky?
A6: Účinnosť enzýmu TAQ je relatívne veľká. Typicky sú potrebné enzýmy taq s horúcim štartom, ktoré sú relatívne účinné. Pri komerčných fluorescenčných kvantitatívnych súpravách každý výrobca optimalizuje účinnosť najlepšieho stavu podľa vlastných produktov blízko 100 percent, ak je účinnosť príliš nízka, experimentálne výsledky nie je možné získať. Pre produkty rôznych spoločností je to meradlo kvality.
Otázka 7: Ovplyvňuje množstvo fluorescenčného farbiva výsledky experimentu?
A7: Áno, bude. Ak je fluorochróm príliš nasýtený, môže v niektorých nástrojoch spôsobovať rušenie šumom. Ak fluorochróm nie je nasýtený a hodnota fluorescencie je príliš nízka, čoskoro vstúpi do fázy plateau a krivka amplifikácie bude plochá. Vo fluorescenčnom kvantitatívnom experimente sa vidí hlavne hodnota CT, takže nie je dôležité, aby krivka neskorej amplifikácie vstúpila do štádia plató, ale obraz nie je dostatočne krásny. Ak ste si museli vybrať, začnite výberom fluorochrómu, ktorý je o niečo menej nasýtený. Pri použití rovnakého produktu od tej istej firmy je však jeho účinok v podstate zanedbateľný.
Otázka 8: Ovplyvní prenos skúmavky PCR výsledky experimentu?
A8: Áno. V prípade rovnakej šarže spotrebného materiálu od rovnakého výrobcu však možno tento efekt ignorovať. Je to dobrá voľba a najlepšie je použiť 96-doštičku s jamkami s membránou s vysokou priepustnosťou, aby sa minimalizoval vplyv priepustnosti svetla spotrebného materiálu.
Q9: Ovplyvnia chyby počas prevádzky experimentálne výsledky?
A9: Vplyv operačného procesu sa prejavuje hlavne v uniformite. Homogenita znamená, že všetky zložky v systéme sú spolu rovnomerne zmiešané a blesková centrifugácia môže tento problém vyriešiť. Navyše pre začiatočníkov je najlepšie nastaviť PCR systém na viac ako 20 palcov a príliš malý systém je náchylnejší na chyby. Ak je teplota žíhania správne optimalizovaná, účinok koncentrácie priméru na CT je minimalizovaný. A budete vedieť, že niektorým prevádzkovým chybám (ako je koncentrácia primeru) sa dá vyhnúť optimalizáciou teploty žíhania.
Zhrnúť
Vyššie uvedené sú niektoré otázky a otázky, s ktorými sa nováčikovia často stretávajú počas experimentu, dúfame, že tieto otázky vám pomôžu vyriešiť nejaký zmätok. Experimentovanie je proces vytvárania chaosu a riešenia problémov, dúfajme, že z toho niečo získate. Ďakujeme za prečítanie a vidíme sa nabudúce!
