Bežné príčiny abnormálnych bunkových kultúr

V procese bunkovej kultúry sa často vyskytujú problémy jedného alebo druhého druhu. Nepodceňujte bunkovú kultúru, ale obsahuje univerzitné otázky. Komunikáciou s používateľmi nájdete veľa problémov, ktorým sa dá vyhnúť. Nasledujúce sú bežné v procese bunkovej kultúry. Analyzujte príčinu abnormality.

Petriho miska

1. Kultivované bunky nepriľnú k stene

možný dôvod

1. Nadmerné trávenie trypsínom;

2. kontaminácia mykoplazmami;

3. Hodnota pH média je príliš alkalická (rozklad NaHCO3);

4. starnutie buniek;

5. Počiatočná koncentrácia naočkovaných buniek je príliš nízka alebo príliš vysoká.

Riešenie

1. Skráťte čas trávenia trypsínu alebo znížte koncentráciu trypsínu;

2. Izolujte kultúru a zistite mykoplazmu. Vyčistite stojan alebo inkubátor. Ak sa zistí kontaminácia mykoplazmami, kultúru zlikvidujte;

3. Použite sterilný roztok kyseliny octovej na úpravu pH alebo naplňte sterilným CO2;

4. Povoliť nové konzervačné bunky;

5. Upravte optimálnu koncentráciu naočkovaných buniek.

2. Zhlukovanie suspenzných buniek

možný dôvod

1. Kultivačné médium obsahuje ióny vápnika a horčíka;

2. kontaminácia mykoplazmami;

3. Nadmerné trávenie proteázou spôsobuje lýzu buniek;

4. Kontaminácia DNA.

Riešenie

1. Umyte bunky vyváženým soľným roztokom bez vápnika a horčíka a jemne ich vyfúkajte a vysajte

2. Bunky získajú jednobunkovú suspenziu;

3. Oddeľte kultúru a zistite mykoplazmu;

4. Ošetrenie buniek DNaselom.

3. Kultivované bunky rastú pomaly

možný dôvod

1. Kvôli výmene iného kultivačného média alebo séra;

2. Niektoré zložky potrebné na rast buniek v kultivačnom médiu, ako je glutamín alebo rastové faktory, sú vyčerpané alebo chýbajú alebo boli zničené;

3. V kultúre je malé množstvo bakteriálnej alebo plesňovej kontaminácie;

4. Nesprávne skladovanie činidiel;

5. Počiatočná koncentrácia naočkovaných buniek je príliš nízka;

6. Bunky zostarli;

7. Kontaminácia mykoplazmami.

Riešenie

1. Porovnajte zloženie nového média a pôvodného média, porovnajte nové sérum a staré sérum na podporu experimentov bunkového rastu a nechajte bunky postupne sa prispôsobiť novému médiu;

2. Vymeňte za čerstvo pripravené kultivačné médium alebo pridajte glutamín a rastové faktory;

3. Na kultiváciu použite kultivačné médium bez antibiotík, ak sa zistí, že je kontaminované, kultúru zlikvidujte;

4. Sérum by sa malo skladovať pri -10 až -20 stupňoch . Kultivačné médium by sa malo skladovať pri teplote 2-8 stupňov v tme. Kompletné kultivačné médium obsahujúce sérum by sa malo skladovať pri teplote 2-8 stupňa a malo by sa spotrebovať do 1 týždňa;

5. Zvýšte počiatočnú koncentráciu naočkovaných buniek;

6. Zmena na novú konzervačnú bunku;

7. Izolujte kultúru a zistite mykoplazmu. Vyčistite stojan a inkubátor. Ak sa zistí kontaminácia mykoplazmami, kultúru zlikvidujte.

Po štvrté, kultivované bunky rastú zle

možný dôvod

A. Stav samotnej bunky

1. Počet bunkových pasáží je veľký a bunky starnú;

2. Inokulované množstvo buniek: príliš nízke inokulované množstvo, pomalý rast buniek;

3. Prechod buniek je príliš neskoro: bunková otrava, ktorá ovplyvňuje rast buniek po pasáži;

4. Čas trávenia trypsínom je príliš dlhý alebo príliš krátky: ak je čas príliš dlhý, bunky odumierajú; ak je čas príliš krátky, bunky nie sú úplne rozdelené do zhlukov a bunky odumierajú;

5. Kryokonzervácia a obnova buniek: pomalé zmrazenie a okamžitá lýza.

B. Znečistenie

1. Kontaminácia mykoplazmami;

2. Znečistenie plesňou.

C, kultivačné médium alebo sérum

1. Žiadna validácia pred výmenou séra alebo média;

2. Či je vybrané médium vhodné;

3. Či je príprava média vhodná;

4. Či je príprava média presná.

D. kultivovať životné prostredie

1. Je dodávka CO2 normálna?

2. Teplota inkubátora alebo trepačky je správne kontrolovaná.

Riešenie

Podľa vyššie uvedených štyroch možných dôvodov urobte cielené riešenia

1. Venujte pozornosť stavu buniek: ako je počet pasáží, množstvo očkovania atď.;

2. Vyhnite sa znečisteniu (používajte bežné, legálne a vysledovateľné sérum);

3. Použite vhodné sérum alebo médium, najlepšie overené;

4. Venujte pozornosť laboratórnemu prostrediu.

Možné príčiny bunkovej smrti v kultúre

1. V inkubátore nie je žiadny CO2;

2. Teplota v inkubátore príliš kolíše;

3. Bunky sú poškodené počas kryokonzervácie alebo obnovy;

4. Osmotický tlak kultivačného média je nesprávny;

5. Akumulácia toxických metabolitov v kultivačnom médiu.

Riešenie

1. Zistite CO2 v inkubátore;

2. Skontrolujte teplotu v inkubátore;

3. Vezmite nový zachovaný druh bunky;

4. Zistite osmotický tlak kultivačného média;

5. Vymeňte za čerstvé kultivačné médium;