1. Zotavenie
●1. Vyberte kryoskúmavku z tekutého dusíka, ihneď ju vložte do 37-stupňového vodného kúpeľa a mierne ňou pretrepte. Keď sa kvapalina roztopí (asi 1-1,5 minúty), vyberte ju, nastriekajte trochu alkoholu a položte ju na ultračistý pracovný stôl.
●2. Vyššie uvedenú bunkovú suspenziu odsajte do 15 ml centrifugačnej skúmavky naplnenej 10 ml média (skúmavku na kryokonzerváciu umyte médiom, aby ste zmyli všetky bunky priľnuté na stene) a centrifugujte pri 1000 ot./min. počas 5 minút.
●3. Zlejte supernatant a pridajte 1 ml média na suspendovanie buniek. Nasajte do 10 cm Petriho misky obsahujúcej 10 ml kultivačného média a jemne pretrepte tam a späť, aby sa bunky v Petriho miske rovnomerne rozdelili.
●4. Označte typ bunky a dátum, názov kultivátora atď. a umiestnite ju do CO2 inkubátora na kultiváciu. Keď bunky priľnú k stene, vymeňte médium.
●5. Médium vymieňajte každé 3 dni.
2. Pasáž
●1. Prechod, keď pokrytie buniek v kultivačnej miske dosiahne 80 percent -90 percent .
●2. Nasajte pôvodné médium.
●3. Pridajte vhodný trypsín (len toľko, aby pokryl bunky) a trávte 1-2 minút.
●4. Po zaokrúhlení buniek pridajte rovnaký objem média obsahujúceho sérum na ukončenie štiepenia.
●5. Pomocou pipety suspendujte bunky pipetovaním.
●6. Bunky odsajte do 15 ml centrifugačnej skúmavky a centrifugujte pri 1000 ot./min. počas 5 minút.
●7. Zlejte supernatant, pridajte 1-2ml média a nafúknite bunky.
●8. Preneste bunky do niekoľkých misiek v závislosti od typu buniek. Vo všeobecnosti existuje 5 rakovinových buniek a 3 normálne bunky. Pokračujte v pestovaní.
3. Kryokonzervácia Rozštiepte bunky a odstred'ujte (ibid.). Bunky suspendujte v pripravenom mraziacom roztoku a rozdeľte ich do sterilizovaných kryoskúmaviek, nechajte niekoľko minút postáť a uveďte typ buniek a dátum kryokonzervácie. 4 stupne počas 30 minút, -20 stupňov počas 30 minút, -80 stupňov cez noc a potom sa umiestni do tekutého dusíka na uskladnenie. Príprava kryokonzervačného roztoku: 70 percent kompletného média plus 20 percent FBS plus 10 percent DMSO. DMSO by sa mal pomaly pridávať po kvapkách a počas odkvapkávania pretrepávať.
