Bunková kultúra je jedným z najdôležitejších nástrojov používaných v bunkovej a molekulárnej biológii a poskytuje vynikajúci modelový systém na štúdium normálnej fyziológie a biochémie (napr. metabolické štúdie, starnutie), účinkov liekov a toxických zlúčenín na bunky, ako aj účinkov bunkovej mutagenéze a karcinogenéze. Používa sa tiež pri skríningu a vývoji liekov a pri výrobe biologických zlúčenín vo veľkom meradle (napr. vakcíny, terapeutické proteíny). Hlavnou výhodou použitia bunkovej kultúry pre ktorúkoľvek z týchto aplikácií je konzistentnosť a reprodukovateľnosť výsledkov, ktoré možno získať použitím dávky klonálnych buniek.
bunková kultúra
Bunková kultúra znamená odstraňovanie buniek zo zvierat alebo rastlín a ich rast v priaznivom umelom prostredí. Bunky môžu byť odstránené priamo z tkaniva a pred kultiváciou enzymaticky alebo mechanicky disociované, alebo môžu byť odvodené zo zavedených bunkových línií alebo kmeňov
1. Primárny tréning
Primárna kultúra označuje štádium kultivácie po tom, ako boli bunky izolované z tkaniva a množené za vhodných podmienok, kým neobsadia všetok dostupný substrát (tj nedosiahnu konfluenciu). V tomto štádiu musia byť bunky subkultivované (tj pasážované) ich prenesením do novej nádoby s čerstvým rastovým médiom, aby sa poskytol väčší priestor pre pokračujúci rast.
2. Bunkové línie
Po prvej subkultúre sa primárne kultúry nazývajú bunkové línie alebo subklony. Bunkové línie odvodené z primárnych kultúr majú konečnú životnosť (tj sú konečné) a keď sú pasážované, prevládajú bunky s najvyšším rastovým potenciálom, čo vedie k určitému stupňu genotypovej a fenotypovej uniformity v populácii pohlavia.
3. Bunkové línie
Bunková línia sa stáva bunkovým kmeňom, ak sa subpopulácia bunkovej línie aktívne vyberie z kultúry klonovaním alebo inými metódami. Bunkové línie často získavajú ďalšie genetické zmeny po iniciácii rodičovskej línie.
4. Limitované bunkové línie a kontinuálne bunkové línie
Normálne bunky sa zvyčajne delia len obmedzený počet krát, kým stratia svoju schopnosť proliferovať, geneticky podmienená udalosť nazývaná starnutie; tieto bunkové línie sa nazývajú konečné. Niektoré bunkové línie sa však stanú nesmrteľnými procesom nazývaným transformácia, ktorý môže nastať spontánne alebo môže byť indukovaný chemicky alebo vírusovo. Konečná bunková línia sa stáva súvislou bunkovou líniou, keď prejde transformáciou a získa schopnosť neobmedzeného delenia.
Nepretržite kultivované bunkové línie sú náchylné na genetický drift, konečné bunkové línie sú odsúdené na starnutie, všetky bunkové kultúry sú náchylné na mikrobiálnu kontamináciu a dokonca aj v najlepšie fungujúcich laboratóriách môže dôjsť k poruche zariadenia. Pretože zavedené bunkové línie sú cenným zdrojom, ktorého nahradenie je nákladné a časovo náročné, je nevyhnutné ich kryokonzervovať na dlhodobé skladovanie.
Akonáhle sa zo subkultúry získa malý počet zostávajúcich buniek, mali by sa zmraziť ako zásoba semien a chrániť pred všeobecným laboratórnym použitím. Pracovné zásoby možno pripraviť a doplniť zo zásob mrazených semien. Ak je zásoba semien vyčerpaná, potom sa môže kryokonzervovaná pracovná surovina použiť ako zdroj na prípravu čerstvého semena, čím sa dosiahne minimálne zvýšenie množstva od počiatočného zmrazenia.
Najlepší spôsob, ako kryokonzervovať kultivované bunky, je v tekutom dusíku, v kompletnom médiu, v prítomnosti kryoprotektantov, ako je dimetylsulfoxid (DMSO) alebo glycerol. Kryoprotektanty znižujú bod tuhnutia média a tiež znižujú rýchlosť chladenia, čím výrazne znižujú riziko tvorby ľadových kryštálikov, ktoré môžu poškodiť bunky a viesť k bunkovej smrti.
Je známe, že DMSO uľahčuje vstup organických molekúl do tkanív. Pri manipulácii s činidlami obsahujúcimi dimetylsulfoxid by sa malo používať vybavenie a postupy vhodné pre riziká tohto materiálu. Reagencie zlikvidujte v súlade s miestnymi predpismi.
Pestujte bunky zo zmrazených zásob pracovných buniek
Nezabudnite vyplniť denník mobilného bankovníctva
Určte počet pasáží, napr. ak boli predchádzajúce bunky zmrazené a boli trikrát rozmrazené, proces rozmrazovania by bol štvrtým pasážovaním.
Pridajte rastové médium (minimálne médium, teľacie sérum a antibiotiká) do baniek T75 označených bunkovou líniou, číslom pasáže a dátumom
Umiestnite banku vodorovne do CO inkubátora pri 37 stupňoch a 5 percentách CO na aspoň 15 minút. Toto zahreje médium a privedie ho na normálne pH (7.0-7.6)
Zmrazené liekovky s bunkovými líniami rozmrazte v 37-stupňovom vodnom kúpeli za jemného miešania. Aby ste znížili riziko kontaminácie, udržujte o-krúžok a uzáver nad hladinou vody (2-5 minút).
Umiestnite injekčnú liekovku do biologickej bezpečnostnej skrinky (BSL-2). Aby ste predišli kontaminácii, pred otvorením liekovky utrite 70 percentným etanolom.
Preneste obsah zmrazenej bunkovej banky do banky T75 obsahujúcej rastové médium. Banku premiešajte a jemne potraste, aby sa bunky rovnomerne rozdelili po povrchu banky.
Inkubujte banku cez noc v CO2 inkubátore pri 37 stupňoch s 5 percentami CO2. Nechajte bunky priľnúť cez noc
meniace sa médium rastu
Inkubujte banku ďalších 2-4 dní pri teplote 37 stupňov , 5 percent CO2 a monitorujte, kým bunky nenarastú
Akonáhle bunky dosiahnu približne 90-percentnú konfluenciu, bunková zásoba sa môže expandovať pomocou banky T150
